文章轉(zhuǎn)自生物探索

血液是唯一與所有器官都有接觸的組織，攜帶著有關(guān)機(jī)體的大量寶貴信息。在理論上，檢測血液攜帶的 DNA、RNA、囊泡和細(xì)胞殘骸可以幫助人們診斷和監(jiān)控各種疾病。

產(chǎn)前基因篩查是血液檢測的一個(gè)重要應(yīng)用，通過分析孕婦血液中的胎兒DNA來鑒定染色體異常（比如唐氏綜合癥）。此外，越來越多的研究者開始關(guān)注血液循環(huán)中的其他生物學(xué)指標(biāo)，比如RNA、微囊泡和外泌體。

外泌體（Exosomes）發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)八十年代中期，直到近幾年才開始引起科學(xué)家們的注意。外泌體是機(jī)體絕大部分細(xì)胞都能分泌的一種小囊泡，直徑在30 至100nm之間。外泌體裝載的蛋白質(zhì)、調(diào)控性microRNA、DNA片段和其他代謝物，可以反映相應(yīng)組織的內(nèi)部活動。過去在很長一段時(shí)間里，人們曾將外泌體視為無用的碎屑。但現(xiàn)在研究者們意識到，外泌體在細(xì)胞之間起到了信使作用，而且與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。

外泌體受到廣泛關(guān)注是因?yàn)樗哂歇?dú)特的性質(zhì)。外泌體中的大分子不會受到外界核酸酶和蛋白酶的破壞，也就是說其中的生物學(xué)指標(biāo)在一段時(shí)間內(nèi)比較穩(wěn)定。此外，外泌體上的表面標(biāo)志物能夠體現(xiàn)它的細(xì)胞來源，人們可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行特異性的富集，比如專門收集來自腫瘤的外泌體。外泌體還有一個(gè)明顯的優(yōu)勢：它們只揭示活細(xì)胞的情況。因?yàn)橹挥谢罴?xì)胞才能分泌外泌體。研究者們可以通過外泌體來監(jiān)控活細(xì)胞，無視那些因?yàn)樗幬镏委煻鵀l臨死亡的細(xì)胞。

微囊泡（Microvesicles）是從細(xì)胞表面被動分離出來的，一般比較大，直徑可達(dá)1,000 nm。不同類型的微囊泡持有不同的細(xì)胞信息，很可能需要特別的提取方案。近年來人們逐漸意識到，細(xì)胞外微囊泡對癌癥的發(fā)展和復(fù)發(fā)起到了重要作用。華中科技大學(xué)的研究人員在Cancer Research雜志上發(fā)表文章指出，微囊泡中的miRNA會推動造血細(xì)胞的白血病轉(zhuǎn)化。研究顯示，慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）K562細(xì)胞的微囊泡，能使正常造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘籽蛹?xì)胞。

血液生物學(xué)指標(biāo)的商業(yè)化檢測目前主要集中在癌癥領(lǐng)域。也有許多學(xué)術(shù)研究者嘗試用這種方式改善其他疾病的檢測和診斷。不過，研究者們一直沒能在檢測方法上達(dá)成一致。“我們還處于探索階段，”美國轉(zhuǎn)化基因組研究所的Kendall Van Keuren-Jensen說?！按蠹叶枷雽?shí)現(xiàn)監(jiān)測方法的標(biāo)準(zhǔn)化，但現(xiàn)在還很難說什么才是最好的方法?！?

為了幫助大家更好的分離囊泡、提取RNA、存儲樣本和分析數(shù)據(jù)，The Scientist雜志與多位專家學(xué)者探討了檢測不同血液生物學(xué)指標(biāo)的策略，貢獻(xiàn)出了相應(yīng)的注意事項(xiàng)和實(shí)驗(yàn)技巧。

甲基化圖譜分析

表觀遺傳學(xué)修飾可以在不改變DNA序列的情況下調(diào)控基因的活性，對于人類發(fā)育、人類疾病和環(huán)境影響有深遠(yuǎn)的意義，是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的一大研究熱點(diǎn)。DNA甲基化是最常見的一種表觀遺傳學(xué)修飾，廣泛參與了細(xì)胞對基因表達(dá)的控制，在細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和疾病狀態(tài)中起到了關(guān)鍵性的作用。

研究者：香港中文大學(xué)的盧煜明（Dennis Yuk-ming Lo）教授

盧煜明教授是分子生物學(xué)臨床應(yīng)用專家，尤其致力于研究人體內(nèi)血液的DNA和RNA?，F(xiàn)為香港中文大學(xué)李嘉誠健康科學(xué)研究所所長、李嘉誠醫(yī)學(xué)講座教授兼化學(xué)病理學(xué)講座教授。他屢獲國際殊榮，包括2005年國家自然科學(xué)獎、2006年國際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)合會—分子診斷學(xué)杰出貢獻(xiàn)獎、2006年美國國家臨床生物化學(xué)學(xué)院（NACB）杰出科學(xué)家獎、2006年裘槎基金會優(yōu)秀醫(yī)學(xué)科研者獎、2007年美國臨床化學(xué)協(xié)會（AACC）SigiZiering獎、2012年AACC-NACB臨床化學(xué)杰出貢獻(xiàn)獎、2009年富布賴特香港杰出學(xué)者獎，以及2014年費(fèi)薩爾國王國際醫(yī)學(xué)獎。盧教授亦于2011年被選為英國皇家學(xué)會院士，在2013年被選為美國國家科學(xué)院外籍院士。2015年獲美國臨床化學(xué)協(xié)會（AACC）頒授年度Wallace H. Coulter講學(xué)獎，是全世界首位獲獎的華人學(xué)者。

研究項(xiàng)目：根據(jù)血液中的甲基化DNA分析機(jī)體器官的狀態(tài)

背景：盧教授是無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的奠基人，率先提出了在孕婦血液中檢測胎兒DNA的理論?！把篋NA本質(zhì)上是來源于不同器官的DNA混合物，我希望能夠通過血液檢測來判斷機(jī)體不同部位的異常，”盧教授介紹道。

工作進(jìn)展：為了解決多種組織在血液中的DNA貢獻(xiàn)，盧教授的研究團(tuán)隊(duì)從十四種不同組織（包括肝臟，血細(xì)胞，胎盤等等）的甲基化組中挖掘出5,820個(gè)帶有足夠組織信息的甲基化生物標(biāo)記。然后他們利用二次規(guī)劃法分析多維的方程組，求出關(guān)于各個(gè)組織在血液中貢獻(xiàn)的最優(yōu)解。這就是生物信息學(xué)重迭解析處理（bioinformatics deconvolution process）方法。

研究人員發(fā)表在美國國家科學(xué)院院刊PNAS雜志上的研究顯示，較低的測序覆蓋度也能分辨與移植器官和肝癌有關(guān)的甲基化模式。這種方法能夠給出可靠的信息，鑒定異常循環(huán)DNA的器官來源。舉例來說，研究人員在血液中檢測到了癌細(xì)胞基因組的拷貝數(shù)變異，并且根據(jù)相應(yīng)的甲基化模式找到了這些變異的來源——肝臟腫瘤。

注意事項(xiàng)：研究血液甲基化組會面對許多未知因素，比如甲基化模式在個(gè)體間的變化，甲基化DNA片段在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性。盧教授團(tuán)隊(duì)檢測的甲基化標(biāo)記中大約15%在志愿者之間有顯著差異。由于測序過程的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化會破壞一些DNA并且產(chǎn)生偏好，單分子測序等更靈敏的方法對血液甲基化研究將更有幫助，盧教授指出。

前景展望：盧教授表示，分析血液中的組織特異性甲基化模式還會有更多的用途，比如追蹤移植排斥或者鑒定循環(huán)腫瘤DNA的來源?！爱?dāng)你不知道哪個(gè)器官出現(xiàn)異常的時(shí)候，這是一個(gè)很好的突破口?！?

實(shí)際上，盧教授已經(jīng)領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊(duì)在美國國家科學(xué)院院刊PNAS雜志上發(fā)表了這方面的研究成果。他們通過分析血液中的甲基化DNA，檢測到了癌癥患者的肝腫瘤和淋巴瘤，以及孕婦胎盤中的遺傳異常。這項(xiàng)工作在分子診斷與基于器官的傳統(tǒng)醫(yī)療之間搭起了一道橋梁。

外泌體蛋白

外泌體發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)八十年代中期，直到近幾年才開始引起科學(xué)家們的注意。外泌體是機(jī)體絕大部分細(xì)胞都能分泌的一種小囊泡，直徑在40-100nm之間。一些外泌體相當(dāng)于膜形成的垃圾袋，是細(xì)胞清除特定大分子的一種途徑。另一些外泌體是細(xì)胞之間的一種通訊工具，能夠?qū)?xì)胞功能產(chǎn)生影響。

在過去很長一段時(shí)間里，外泌體并沒有引起人們的注意。直到最近研究者們才逐漸意識到，外泌體所含的多種分子可以成為理想的生物學(xué)指標(biāo)。外泌體內(nèi)的大分子比較穩(wěn)定，不會受到外界核酸酶和蛋白酶的破壞。外泌體的表面標(biāo)志物能夠體現(xiàn)它的細(xì)胞來源。而且外泌體只反映活細(xì)胞的內(nèi)部情況。（更多詳細(xì)信息參見：外泌體的生物學(xué)指標(biāo)及研究工具）

研究者：加州大學(xué)醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)教授Edward Goetzl

研究項(xiàng)目：分析循環(huán)外泌體中的蛋白，開發(fā)阿爾茨海默癥血液測試

背景：阿爾茨海默癥（AD）是一種進(jìn)程性的神經(jīng)退行性疾病，俗稱為老年癡呆癥。阿爾茨海默氏癥患者的認(rèn)知和記憶功能會不斷惡化，極大的影響其日常生活能力，這種疾病是老齡化社會面臨的一大難題。

目前醫(yī)生們主要通過臨床癥狀、大腦成像和腦脊液提取來診斷阿爾茨海默癥。雖然這些診斷往往是正確的，但只有尸檢才能證實(shí)疾病標(biāo)志的存在：大腦中的β淀粉樣蛋白斑塊和tau錯(cuò)誤折疊形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。源自神經(jīng)元的外泌體含有細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)和RNA。如果可以通過循環(huán)外泌體追蹤異常的β淀粉樣蛋白和tau蛋白，那么定期血檢就可以用來監(jiān)控阿爾茨海默癥患者的疾病進(jìn)程。

蛋白質(zhì)檢測：Goetzl及其同事收集了阿爾茨海默癥患者確診前后的血樣。他們先用System Biosciences公司的ExoQuick分離血樣中的所有外泌體，再用結(jié)合神經(jīng)元表面蛋白的抗體富集神經(jīng)元外泌體，檢測這些外泌體所含的蛋白質(zhì)。研究顯示，在阿爾茨海默癥患者的神經(jīng)元外泌體中，tau、磷酸化tau和β淀粉樣蛋白的表達(dá)水平顯著較高。舉例來說，阿爾茨海默癥神經(jīng)元外泌體的磷酸化tau比對照多十倍。

研究人員指出，尋找正確的群體進(jìn)行比較是非常關(guān)鍵的，因?yàn)樵S多老年人已經(jīng)表現(xiàn)出認(rèn)知衰退的跡象。這項(xiàng)研究募集的志愿者不僅認(rèn)知能力正常，而且沒有阿爾茨海默癥家族史，也不具備已知的疾病風(fēng)險(xiǎn)因子。（Alzheimers Dement, 11:600-07, 2015）

注意事項(xiàng)：現(xiàn)在還不清楚血液中神經(jīng)元外泌體的總量是否會隨著疾病狀態(tài)發(fā)生改變，因此我們應(yīng)該適當(dāng)處理數(shù)據(jù)，在單個(gè)外泌體水平上進(jìn)行分析。此外，蛋白質(zhì)從外泌體提取出來之后需要迅速分析，“外泌體把蛋白質(zhì)保護(hù)得很好，一旦我們將蛋白質(zhì)提取出來，它們就很容易降解，”Goetzl指出。

前景展望：2013年Goetzl與人合作建立了NanoSomiX公司，以開發(fā)阿爾茨海默癥血液測試?！拔覀兿Ｍ軌蛱崆?0-15年鑒定到疾病風(fēng)險(xiǎn)，讓高風(fēng)險(xiǎn)人群使用預(yù)防性藥物，”他說。

Exosome Diagnostics公司去年開發(fā)了一種基于離心柱的簡便方法來分離外泌體，并提取出其中的RNA。研究人員在《PLoS ONE》上介紹了這種新方法。與超速離心相比，這種方法能分離出高純度的RNA，并且對囊泡RNA有著高的特異性。離心柱能夠容納4 mL樣本，實(shí)現(xiàn)了血清和血漿中低豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測。目前，基于此技術(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品 – exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit – 已由QIAGEN推出。

外泌體microRNA

研究者：Illinois大學(xué)副教授Neil Smalheiser

研究項(xiàng)目：從血漿外泌體鑒定阿爾茨海默癥的miRNA指標(biāo)

研究背景：外泌體與其他囊泡的區(qū)別主要在于尺寸、浮力密度、形成機(jī)制和特定細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)。MicroRNA（miRNA）是長約22nt的非編碼RNA，這些小RNA在天然細(xì)胞中大量存在，它們能與靶基因的mRNA配對，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。大量研究表明，microRNA控制著胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、器官生成等重要的生物學(xué)過程，對于正常發(fā)育、細(xì)胞生長和生物行為非常關(guān)鍵，而且與復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。近來不少研究者發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默癥患者的大腦組織和血液都存在miRNA水平的改變。

檢測miRNA：Smalheiser團(tuán)隊(duì)使用了分離外泌體的傳統(tǒng)方法——差速離心（differential ultracentrifugation）。他們用這種方法逐漸洗掉游離RNA、蛋白聚合物和細(xì)胞殘骸，只留下外泌體。隨后研究人員從外泌體提取RNA并對其進(jìn)行測序，建立了成熟miRNA的數(shù)據(jù)集。他們通過計(jì)算模型鑒定了一組可以將阿爾茨海默癥和對照準(zhǔn)確分開的miRNA。

不過，超速離心速度較慢，也無法實(shí)現(xiàn)高通量。此外，超速離心中有許多變量需要標(biāo)準(zhǔn)化（例如轉(zhuǎn)子的選擇和離心條件等等），很難轉(zhuǎn)化到臨床中去。好在，市場上出現(xiàn)了多款方便的試劑盒。比如，賽默飛世爾科技推出了幾款總外泌體提取試劑盒（Total Exosome Isolation Reagent），能夠分別從細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、血漿、尿液及其他體液中分離出完整的外泌體。

實(shí)驗(yàn)技巧：研究人員使用的離心方法使他們能夠獲得相對純凈的外泌體，Smalheiser指出。在用Trizol試劑提取RNA的時(shí)候，他的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)添加糖原使產(chǎn)量提升了將近23%，這一步驟可以用于其它低產(chǎn)量RNA。

在實(shí)驗(yàn)室中，RNA提取過程的痛苦是眾所周知的。RNA極其脆弱，對RNAses酶的降解非常敏感，而這種酶幾乎無處不在。美國佛羅里達(dá)大學(xué)的研究人員為此開發(fā)了一種新的RNA提取方法，并將其發(fā)布在《Applications in Plant Sciences》上。他們將Trizol試劑、Turbo DNA試劑盒（由Life Technologies Ambion生產(chǎn)）和自己開發(fā)的步驟結(jié)合起來，讓RNA提取變得更迅速、更有效、更可靠。

細(xì)胞外RNA

研究者：加州大學(xué)圣地亞哥分校副教授Louise Laurent，美國轉(zhuǎn)化基因組研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen

研究項(xiàng)目：鑒定胎盤功能障礙（Laurent）和大腦損傷（Keuren-Jensen）的循環(huán)miRNA指標(biāo)

研究背景：近年來，人們在血漿或血清樣本中成功檢測到了疾病相關(guān)的RNA（exRNA）。這些細(xì)胞外RNA可以成為非侵入性的疾病診斷指標(biāo)，這是RNA檢測最有前景的發(fā)展方向之一。在多種細(xì)胞受到破壞的疾病中（比如大腦損傷），循環(huán)miRNA是非常重要的生物學(xué)指標(biāo)。研究這些miRNA的團(tuán)隊(duì)很多，可供選擇的實(shí)驗(yàn)方案也不少，不過研究者們還沒有就此達(dá)成一致。Laurent和Keuren-Jensen都是美國NIH細(xì)胞外RNA交流協(xié)會的成員，他們正在努力推動循環(huán)miRNA檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，提升細(xì)胞外RNA研究的可重復(fù)性。

胎盤囊泡：在妊娠期間，胎盤會將包含RNA的囊泡釋放到母體血液中。Laurent希望從中鑒定胎盤疾病的miRNA指標(biāo)，比如子癇前期和宮內(nèi)生長受限。她和同事正在優(yōu)化自己開發(fā)的方法，從外泌體和微囊泡提取miRNA并分析相關(guān)數(shù)據(jù)。初步研究結(jié)果顯示，母體血液中的外泌體和微囊泡都可以分離出妊娠特異性miRNA。妊娠后期的miRNA指標(biāo)與胎盤組織的關(guān)系尤為密切。

大腦撞擊：Van Keuren-Jensen團(tuán)隊(duì)將監(jiān)控撞擊數(shù)據(jù)的感應(yīng)器裝在橄欖球運(yùn)動員的頭盔中，并在橄欖球賽季中收集運(yùn)動員的血液、尿液和唾液樣本。他們對這些樣本進(jìn)行RNA測序，尋找與撞擊數(shù)據(jù)有關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)。研究人員使用了一系列商業(yè)化試劑盒，并且對細(xì)胞外RNA收集方法進(jìn)行了比較?！笆褂貌煌脑噭┖谢蚍蛛x方法會造成很大的差異，”Van Keuren-Jensen說?！艾F(xiàn)在還很難斷言哪種試劑盒最好?！?

注意事項(xiàng)：有些測序試劑盒使用帶“粘性”末端的短片段DNA來結(jié)合要擴(kuò)增的目標(biāo)分子。這些末端（被稱為接頭）可能給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來很大的變數(shù)。有些試劑盒產(chǎn)生的接頭二聚體比較少，但測序偏好比較大。有些試劑盒提供的接頭更隨機(jī)化，可能與某些miRNA結(jié)合得更好?！斑@些因素會使結(jié)果產(chǎn)生較大差異，導(dǎo)致難以重復(fù)的結(jié)果，”Van Keuren-Jensen說。

實(shí)驗(yàn)技巧：Laurent指出，減少樣本批次、盡量由同一個(gè)人操作有助于降低結(jié)果的差異性。使用內(nèi)參（比如不受疾病影響的一種RNA）是提高結(jié)果可重復(fù)性得另一條途徑。在沒有一個(gè)通用標(biāo)準(zhǔn)的情況下，“設(shè)立內(nèi)參可以幫你去除產(chǎn)量或批次差異帶來的許多影響，”Laurent說。Van Keuren-Jensen建議大家在論文中分享自己所用的試劑盒和分離方法，因?yàn)檫@些信息對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)很有幫助。

監(jiān)控exRNA只需要采集血樣，不像腫瘤活檢那么有風(fēng)險(xiǎn)，成本也比較低。不過從血漿或血清中分離exRNA仍有一定的挑戰(zhàn)性，一方面是因?yàn)閑xRNA豐度低，另一方面是因?yàn)檠褐械奈廴疚飼种芇CR。商品化的試劑盒能簡化和加速exRNA提取過程，已成為循環(huán)exRNA研究不可缺少的工具。然而很少有人橫向評估這些試劑盒的提取效率如何，是否能去除血漿中的污染物，是否會偏向特定的RNA。而這類評估對于結(jié)果解釋和實(shí)驗(yàn)之間的比較都很關(guān)鍵。

于是，美國愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的研究人員評估了市場上7種常用的exRNA提取試劑盒，分別來自貝克曼?庫爾特、Life Technologies、Exiqon、Zymo、QIAGEN公司。他們具體評估了合成RNA的總體回收率、不同大小的合成RNA的回收能力、exRNA產(chǎn)量和純度，以及純化后的擴(kuò)增效率。研究結(jié)果發(fā)表在《BioTechniques》雜志上。

早期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是無癥狀的，并且很難檢測到，因?yàn)槟壳皼]有可用的NSCLC血液測試。最近，在Cell子刊《EBioMedicine》發(fā)表的一項(xiàng)研究中，南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的張辰宇教授和南京大學(xué)附屬金陵醫(yī)院的張春妮教授帶領(lǐng)的研究小組，確定了一組（五個(gè)）血清microRNA（miRNA），作為NSCLC診斷的潛在生物標(biāo)志物。